Ключові слова
кларитроміцин
антибактеріальні засоби
біоплівки
Quorum sensing
фактори вірулентності
Pseudomonas aeruginosa
експресія генів
Анотація
Макроліди ІІ покоління (азитроміцин і кларитроміцин) широко застосовуються при захворюваннях дихальних шляхів. Окрім антибактеріальної активності щодо планктонних клітин грампозитивних мікроорганізмів, їм притаманна антибіоплівкова та антивірулентна дія, зокрема щодо Pseudomonas aeruginosa. Однак інформація стосовно генетичної регуляції цієї антивірулентної дії обмежена та потребує комплексного дослідження. Мета дослідження – вивчити вплив макролідних антибіотиків азитроміцину та кларитроміцину на фактори вірулентності й активність генів, асоційованих із ними, у P. aeruginosa. Мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) макролідів щодо клінічного тест-штаму P. aeruginosa 449 визначали методом серійних мікророзведень. Антивірулентні властивості азитроміцину та кларитроміцину оцінювали в межах концентрацій від 0,15 МІК до 2,0 МІК, визначаючи гемолітичну, протеазну активності, рухливість бактерій та експресію генів, відповідальних за Quorum sensing-залежні процеси. Вплив макролідів (0,5 МІК) на експресію генів у P. aeruginosa досліджували за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі методом 2-ΔΔСt. Для статистичної обробки результатів використовували метод ANOVA. Встановлено, що макроліди азитроміцин і кларитроміцин виявляють антивірулентні властивості щодо P. aeruginosa. За дії азитроміцину та кларитроміцину протеазна активність бактерій знижується на 10,1–24,8 % порівняно з контролем. Інгібувальний ефект азитроміцину щодо гемолітичної активності P. aeruginosa, обумовленої позаклітинними гемолізинами, зареєстрований при 0,15 МІК та 0,25 МІК (зменшення у 10,1 і 10,4 разу), клітинно-асоційованими гемолізинами – за впливу 0,15–0,5 МІК (зменшення у 2,9–3,7 разу). Дія кларитроміцину на гемолітичну активність бактерій поступається азитроміцину. Вплив макролідів на рухливість бактерій залежить від типу міграції, препарату та його концентрації, проте найвираженіший ефект відмічено на swimming- та swarming-міграцію. Отримані дані свідчать, що азитроміцин і кларитроміцин обумовлюють зміни в експресії генів, які регулюють синтез факторів вірулентності. За їхнього впливу значно знижується експресія генів aprA, exoА та toxА. Транскрипційна активність гена exoS за дії азитроміцину збільшується (у 13,5 разу), кларитроміцину – не змінюється. Макроліди знижують у 2,5–20 разів експресію генів lasI, rhlI (лише азитроміцин), rhlR, pqsR (кларитроміцин) та збільшують у 1,9–3,7 разу активність генів lasR. pqsR (азитроміцин), які беруть участь у функціонуванні систем Quorum sensing у P. aeruginosa. Таким чином, антивірулентна активність азитроміцину та кларитроміцину щодо P. aeruginosa реалізується шляхом впливу на гемолітичну, протеазну активність і рухливість бактерій. Макролідні антибіотики, змінюючи рівень експресії генів, здатні порушувати синтез факторів вірулентності та функціонування систем Quorum sensing, які відіграють ключову роль на всіх етапах розвитку інфекційного процесу.
Посилання
Respiratory tract infections and laboratory diagnostic methods: a review with a focus on syndromic panel-based assays. A. Calderaro, M. Buttrini, B. Farina et al. Microorganism. 2022. V. 10 (9). P. 1856. https://doi.org/10.3390/microorganisms10091856.
3. Spagnolo Р., Fabbri L. M., Bush A. Long-term macrolide treatment for chronic respiratory disease. European Respiratory Journal. 2013. V. 42 (1). P. 239–251. https://doi.
org/10.1183/09031936.00136712.
4. Sandman Z., Iqbal O. A. Azithromycin. 2024 Nov 9. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2025. PMID: 32491698.
5. Nonantimicrobial actions of macrolides: overview and perspectives for future development. J. A. Kricker, C. P. Page, F. R. Gardarsson et al. Pharmacological Reviews. 2021. V.73 (4). P. 1404–1433. https://doi.org/10.1124/pharmrev.121.000300.
6. Pharmacokinetics of macrolide antibiotics and transport into the interstitial fluid: comparison among Erythromycin, Clarithromycin, and Azithromycin. S. Kobuchi, T. Kabata, K. Maeda et al. Antibiotics. 2020. V.9 (14). P. 199. https://doi.org/10.3390/antibiotics9040199.
7. Davidson R. J. In vitro activity and pharmacodynamic/pharmacokinetic parameters of clarithromycin and azithromycin: why they matter in the treatment of respiratory tract infections. Infect. Drug Resist. 2019. V. 12. Р. 585–596. https://doi.org/10.2147/IDR.S187226.
8. Insights into Haemophilus macrolide resistance: a comprehensive systematic review and meta-analysis. I. Ahmad, A. Kubaev, A. H. Zwamel et al. PLoS Negl. Trop. Dis. 2025. V. 19 (3). P. e0012878. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0012878.
9. Наказ МОЗ України від 23.08.2023 № 1513 «Про затвердження Стандарту медичної допомоги «Раціональне застосування антибактеріальних і антифунгальних препаратів з лікувальною та профілактичною метою».
10. Shinkai M., Rubin B. K. Macrolides and airway inflammation in children. Paediatric Respiratory Reviews. 2005. V. 6 (3). P. 227–235. https://doi.org/10.1016/j.prrv.2005.06.005.
11. Effect of subinhibitory concentrations of macrolides on expression of flagellin in Pseudomonas aeruginosa and Proteus mirabilis. I. Ahmad, A. Kubaev, A. H. Zwamel et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2000. V. 44 (10). P. 2869–2872. https://doi.org/10.1128/AAC.44.10.2869-2872.2000.
12. Macrolide resistance through uL4 and uL22 ribosomal mutations in Pseudomonas aeruginosa. L. Goltermann, P. Laborda, O. Irazoqui et al. Nat. Commun. 2024. V. 15 (1). P. 8906. https://doi.org/10.1038/s41467-024-53329-8.
13. Imperi F., Leoni L., Visca P. Antivirulence activity of azithromycin in Pseudomonas aeruginosa. Front. Microbiol. 2014. V. 5 (178). P. 178. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00178.
14. Macrolide antibiotics (including azithromycin) for cystic fibrosis. K. W. Southern, A. Solis-Moya, D. Kurz. Cochrane Database Syst Rev. 2024. V. 2 (2). P. CD002203. https://doi.org/10.1002/14651858.CD002203.pub5.
15. EUCAST: Clinical break points and dosing of antibiotics. ESCMID – European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases – 2023. URL: https://www.eucast.org/clinical_breakpoints.
16. International Standards Organization. ISO 20776-1:2019. Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices. Part 1: Broth micro-dilution reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. Geneva : ISO, 2019.
17. Lankisch P. G, Vogt W. Direct haemolytic activity of phospholipase A. Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 270 (2). Р. 241–247. https://doi.org/10.1016/0005-2760(72)90235-4.
18. Montville T. J. Dual-substrate plate diffusion assay for proteases. Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 45 (1). Р. 200–204. https://doi.org/10.1128/aem.45.1.200-204.1983.
19. Fonseca A. P., Sousa J. C. Effect of antibiotic-induced morphological changes on surface properties, motility and adhesion of nosocomial Pseudomonas aeruginosa strains under different physiological states. J. Appl. Microbiol. 2007. V. 103 (5). Р. 1828–1837. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03422.x.
20. Kinscherf T. G, Willis D. K. Swarming by Pseudomonas syringae B728a requires gacS (lemA) and gacA but not the acyl-homoserine lactone biosynthetic gene ahlI. J. Bacteriol. 1999. V. 181 (13). Р. 4133–4136. https://doi.org/10.1128/JB.181.13.4133-4136.1999.
21. Aspirin is an efficient inhibitor of quorum sensing, virulence and toxins in Pseudomonas aeruginosa. S. A. El-Mowafy, K. H. Abd El Galil, S. M. El-Messery, M. I. Shaaban. Microb. Pathog. 2014. V. 74. P. 25–32. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2014.07.008.
22. Relative expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes analyzed by a real time RT-PCR method during lung infection in rats. B. Joly, M. Pierre, S. Auvin et al. FEMS Microbiol. Lett. 2005. V. 243 (1). P. 271–278. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2004.12.012.
23. Khattab M. A., Nour M. S., Sheshtawy N. M. Genetic identification of Pseudomonas aeruginosa virulence genes among different isolates. J. Microb. Biochem. Technol. 2015. V.7 (5). P. 274–277. https://doi.org/10.4172/1948-5948.1000224.
24. Biofilm formation and virulence factors among Pseudomonas aeruginosa isolated from burn patients. Z. Ghanbarzadeh Corehtash, A. Khorshidi, F. Firoozeh et al. Jundishapur J. Microbiol. 2015. V. 8 (10). P. e22345. https://doi.org/10.5812/jjm.22345.
25. Localized gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms. A. P. Lenz, K. S. Williamson, B. Pitts et al. Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74 (14). P. 4463–4471. https://doi.org/10.1128/AEM.00710-08.
26. Zelena L., Gretsky І., Gromozova Е. Influence of ultrahigh frequency irradiation on Photobacterium phosphoreum luxb gene expression. Cent. Eur. J. Biol. 2014. V. 9 (10). P. 1004–1010. https://doi.org/10.2478/s11535-014-0347-5.
27. Livak K. J., Schmittgen T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001. V. 25 (4). P. 402–408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.
28. Kim T., Li X., Lee J. Alleviation of Pseudomonas aeruginosa infection by propeptide-mediated inhibition of protease IV. Microbiol. Spectr. 2021. V. 9 (2). P. e00782-21. https://doi.org/10.1128/Spectrum.00782-21.
29. Protease IV, a quorum sensing-dependent protease of Pseudomonas aeruginosa modulates insect innate immunity. S. J. Park, S. K. Kim, Y. I. So et al. Mol. Microbiol. 2014. V. 94 (6). P. 1298-1314. https://doi.org/10.1111/mmi.12830.
30. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa secreted virulence factors reduces lung inflammation in CF mice. A. Sandri, A. Ortombina, F. Boschi et al. Virulence. 2018. V. 9 (1). P. 1008-1018. https://doi.org/10.1080/21505594.2018.1489198.
31. Shibl A. M., Al-Sowaygh I. A. Antibiotic inhibition of protease production by Pseudomonas aeruginosa. J. Med. Microbiol. 1980. V.13 (2). P. 345–348. https://doi.org/10.1099/00222615-13-2-345.
32. Extracellular enzymes and toxins of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from clinically diseased Egyptian cows. G. Younis, A. Awad, M. Maghawry, F. Selim. Adv. Anim. Vet. Sci. 2015. V. 3 (10). P. 522-526. https://doi.org/10.14737/journal.aavs/2015/3.10.522.526.
33. Shi W., Sun H. Type IV pilus-dependent motility and its possible role in bacterial pathogenesis. Infect. Immun. 2002. V. 70 (1). Р. 1-4. https://doi.org/10.1128/IAI.70.1.1-4.2002.
34. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella
and pili. T. Köhler, L. K. Curty, F. Barja et al. J. Bacteriol. 2000. V. 182 (21). P. 5990–5996. https://doi.org/10.1128/JB.182.21.5990-5996.2000.
35. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics. S. Qin, W. Xiao, C. Zhou et al. Signal Transduct. Target Ther. 2022. V. 7 (1). P. 199. https://doi.org/10.1038/s41392-022-01056-1.
36. The role of exos in dissemination of Pseudomonas aeruginosa during pneumonia. S. M. Rangel, M. H. Diaz, C. A. Knoten et al. PLoS Pathog. 2015. V. 11 (6). P. e1004945. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004945.
37. ExoS effector in Pseudomonas aeruginosa hyperactive type III secretion system mutant promotes enhanced plasma membrane rupture in neutrophils. A. D. Reuven, S. Katzenell, B. W. Mwaura, J. B. Bliska. PLoS Pathog. 2025. V. 21 (4). P. e1013021. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013021.
38. Iwański B., Mizerska-Kowalska M., Andrejko M. Pseudomonas aeruginosa exotoxin A induces apoptosis in Galleria mellonella hemocytes. Journal of Invertebrate Pathology. 2023. V. 197. 107884. https://doi.org/10.1016/j.jip.2023.107884.
39. Haghi F., Nezhad B. B., Zeighami H. Effect of subinhibitory concentrations of imipenem and piperacillin on Pseudomonas aeruginosa toxA and exoS transcriptional expression. New Microbes New Infect. 2019. V. 8(32). 100608. https://doi.org/10.1016/j.nmni.2019.100608.
40. Could Azithromycin be part of Pseudomonas aeruginosa acute pneumonia treatment? A. G. Leroy, J. Caillon, N. Caroff et al. Front. Microbiol. 2021. V. 12. P. 642541. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.642541.
41. Azithromycin attenuates Pseudomonas-induced lung inflammation by targeting bacterial proteins secreted in the cultured medium. T. Leal, G. Bergamini, F. Huaux et al. Front. Immunol. 2016. V. 7. P. 499. https://doi.org/10.3389/fimmu.2016.00499.
42. Growth-phase-dependent modulation of quorum sensing and virulence factors in Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 by Sub-MICs of Antibiotics. A. N. Amer, N. Attia, D. Baecker et al. Antibiotics. 2025. V. 14 (7). P. 731. https://doi.org/10.3390/antibiotics14070731.
43. Periodically disturbing biofilms reduces expression of quorum sensing-regulated virulence factors in Pseudomonas aeruginosa. L. García-Diéguez, G. Diaz-Tang, E. Marin Meneses et al. iScience. 2023. V. 26 (6). P. 106843. https://doi.org/10.1111/mmi.13611.
44. Farrow J. M., Pesci E. C. Distal and proximal promoters co-regulate pqsR expression in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 2017. V. 104 (1). Р. 78–91. https://doi.org/10.1111/mmi.13611.
45. Mechanism of azithromycin inhibition of HSL synthesis in Pseudomonas aeruginosa. J. Zeng, N. Zhang, B. Huang et al. Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 24299. https://doi.org/10.1038/srep24299.
46. Azithromycin inhibits quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. K. Tateda, R. Comte, J. C. Pechere et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2001. V. 45 (6). Р. 1930–1933. https://doi.org/10.1128/AAC.45.6.1930-1933.2001.
47. Quorum-sensing antagonistic activities of azithromycin in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a global approach. Y. Nalca, L. Jänsch, F. Bredenbruch et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2006. V. 50 (5). Р. 1680–1688. https://doi.org/10.1128/AAC.50.5.1680-1688.2006.
48. Lee K., Yoon S.S. Pseudomonas aeruginosa biofilm, a programmed bacterial life for fitness. J. Microbiol. Biotechnol. 2017. V. 27 (6). Р. 1053–1064. https://doi.org/10.4014/jmb.1611.11056.
49. Chadha J. Harjai K., Chhibber S. Revisiting the virulence hallmarks of Pseudomonas aeruginosa: a chronicle through the perspective of quorum sensing. Environ. Microbiol. 2022. V. 24 (6). Р. 2630–2656. https://doi.org/10.1111/1462-2920.15784.